實時熒光定量 PCR，又稱為定量 PCR 或 qPCR，可以為測定樣品中的靶標序列或基因數量提供簡單、簡潔的方法。該方法高度簡化，有時會忽略實現方法方面的關鍵因素，因此導致出現問題。本文將重點強調設置和評估實時熒光定量 PCR 反應時必須考慮的這些因素。

可能影響 Ct 的因素

Ct（閾值循環）是擴增曲線與閾值線的交叉點（圖 1B）。它是 PCR 反應中靶標濃度的相對測量。除靶標濃度之外，還有很多因素會影響 Ct 的絕對值。我們將要討論最常見的可能影響 Ct 值的非模板依賴性因素，并描述如何評估實時熒光定量 PCR 反應的性能。

上述圖 1 顯示實時反應擴增圖的幾個參數。圖 1B 中的指數期對應于圖 1C 中的線性期。在圖 1C 中，閾值必須設在擴增圖的線性期中。Ct 值隨模板量減少而增加。然而，反應混合物或儀器中的任何干擾，只要能影響與 Ct 計算相關的熒光測定，都會使 Ct 值產生非模板依賴性的變化。因此，在不同條件下或用不同試劑進行的 PCR 反應產生的 Ct 值不可以直接進行比較。 

圖 2.  在使用具有相同 ROX 水平的兩種預混液的一次檢測中獲得的原始熒光數據。信號差異是由預混液的成分造成的。使用 Applied Biosystems? VIC?/MGB 探針在 Applied Biosystems? 7900HT 快速實時熒光定量 PCR 系統上執行此反應。x 軸顯示熒光基團的的發射波長，y 軸顯示發射強度。

任何分子的熒光發射都受環境因素的影響，比如溶液的 pH 值和鹽濃度。圖 2 顯示某個 Applied Biosystems? TaqMan? 探針在兩種不同預混液背景下的原始熒光數據。請注意，盡管兩組反應的靶標、探針和 ROX 染料濃度都相同，預混液 A 中的熒光強度更高。

因此，如圖 3 所示，產生的 ΔRn 值也不同。請注意，熒光信號基線屬于非模板依賴性因素，兩種預混液的基線是不同的（圖 3A）。Ct 值的變化并沒有反映出反應系統的整體性能（圖 3B）。靈敏度相當的預混液產生的 Ct 絕對值可能不同。

圖 3.使用預混液 A 和預混液 B 在等量的人類 gDNA 中進行 RNase P 擴增。(A) Rn 根據循環數進行繪制，并且顯示兩個反應的基線。(B) 對數 (ΔRn) 根據循環數進行繪制。兩種預混液的閾值（綠線）設定為相同水平。對于相同濃度的靶標而言，預混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于預混液 A 的相應值 (CtA)，表明預混液 B 的基線較低。使用 Applied Biosystems? 7500 實時熒光定量 PCR 系統執行所有擴增。

Rn 值是由 Applied Biosystems? FAM? 染料的熒光除以 ROX 染料的熒光而計算得出的比率。因此，假定 FAM 染料產生的熒光信號保持不變，ROX 染料量越少，產生的 Rn 值就越高。這將導致 Rn 基線上升，以及隨后 ΔRn 的減少和 Ct 值的變化。通過降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值，沒有對反應的真實靈敏度產生任何影響，卻有著意想不到的后果。如圖 4 所示，降低 ROX 染料的濃度可能會增加 Ct 值的標準差。標準差越大，分辨靶濃度之間的細微區別的可信度就越低（參加下文的精確度一節）。

圖 4.  使用包含 3 種不同濃度的 ROX 染料的預混液對 TGF-β 進行擴增。顯示 (A) Ct 值和 (B) 標準差隨 ROX 染料濃度的變化。降低 ROX 染料濃度導致 Ct 出現得更早，但是會增大標準差。使用 Applied Biosystems 7500 實時熒光定量 PCR 系統執行所有擴增。

PCR 反應的效率也會影響 Ct 值。在低效率條件下進行連續稀釋擴增，與高效率條件下相比，可能會產生斜率不同的標準曲線。在圖 5 中，兩個樣品（X 和 Y）分別在低效率和高效率條件下擴增，在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，盡管高效率條件（圖 5 中的藍色曲線）在高濃度時產生的 Ct 值更晚，但它在靶濃度低時卻更為靈敏。PCR 效率取決于實驗、預混液性能和樣品質量。通常情況下，反應效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如儀器、試劑和實驗完全相同， 該效率也有助于得出第一個樣品的模板量更少的結論。然而，如果產生兩個 Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應體積，該結論就不成立。因此，只有在使用上文定義的相同反應條件來比較實驗時，Ct 絕對值的比較才有意義。

圖 5.Ct 隨 PCR 效率發生變化。藍色標準曲線的效率為 100%（斜率為 –3.3）。綠色標準曲線的效率為 78%（斜率為 –4）。與高效率條件相比（藍色），在低效率條件下（綠色），擴增量 Y 使 Ct 出現得更早。較低擴增量 (X) 時則情況相反，與高效率條件（藍色）相比，低效率條件（綠色）使 Ct 出現得更晚。

為了比較不同條件（例如兩種不同的預混液或兩臺不同的儀器）下的兩個反應，必須評估以下參數。

動態范圍

為了正確地評估 PCR 效率，至少需要 3 次重復和至少 5 個數量級倍數的模板濃度。圖 6 說了建議此精確級別的理由，它證明在 1 個數量級倍數與 5 個數量級倍數范圍內測試稀釋模板時，獲得的斜率或效率可能產生數學偏差。因此，即使檢測 100% 有效，由于每個稀釋點都存在標準差，檢測一個數量級倍數的連續稀釋時，可能獲得 70 至 170% 的范圍。在 5 個數量級倍數范圍內做相同數量的稀釋點或重復，可能的偏移只有 ±8%。這意味著在 5 個數量級倍數范圍內，如果效率為 94%，則該實驗的效率范圍介于 88% 到 100% 之間。為了準確測定 PCR 反應的效率，必須進行 5 個數量級倍數的連續稀釋。-3.3 ±10% 的斜率意味著效率達到 100% ±±10%。PCR 反應效率越低，那么靈敏度越低。

R2 值

另一個評估 PCR 效率的關鍵參數是 R2，它是說明如何使用一個數值預測另一個數值的相關程度的統計學術語。如果 R2 為 1，那么 Y 值 (Ct) 可以用來準確預測 X 值（圖7A）。如果 R2 為 0，那么就不能通過 Y 值預測 X 值（圖 7B）。R2 值 >0.99 表示兩個數值之間相關的置信度良好。

精確度

標準差（偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值，則標準差就??；如果許多數據點都遠離平均值，則標準差就大。

實際上，足夠多重復次數產生的數據集會形成大致的正態分布。這經?？赏ㄟ^經典的中心極限定理來證明，該定理稱大量獨立同分布隨機變量的和在無限多時趨向于正態分布。如圖 8A 所示，約 68% 的值在平均值的 1 個標準差之內，約 95% 的值在平均值的 2 個標準差之內，約 99.7% 的值在平均值的 3 個標準差之內。

如果 PCR 效率為 100%，那么 2 倍稀釋時兩個連續濃度之間的 Ct 差為1（圖 8B）。要在 99.7% 以上的情況下定量 2 倍稀釋，標準差必須 ≤0.167。標準差越大，分辨 2 倍稀釋的能力就越低。要在 95% 以上的情況下區別 2 倍稀釋，標準差必須 ≤0.250（圖 8C）。

靈敏度

無論 Ct 絕對值是多少，任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數為 1 的系統都達到了靈敏度的極限。

如前文所述，效率是決定反應靈敏度的關鍵因素（圖 5）。在檢測極低拷貝數時的另一個重要的考慮因素是，不能預期模板為正態分布。相反，它會遵循泊松分布，該分布預測在平均包含一個拷貝的起始模板的大量重復中，實際上約 37% 不含拷貝，僅有約 37% 含有 1 個拷貝，18% 應包含 2 個拷貝（見圖 9）。因此，為了可靠地檢測低拷貝，必須做大量的重復實驗來提供統計顯著性，以克服泊松分布的限制。

圖 6.  準確計算 PCR 效率取決于連續稀釋所用模板量的范圍。對于具有 5 個稀釋點的 2 倍稀釋（橙色）而言，其可能的偏移高于具有 5 個稀釋點的 10 倍稀釋（藍色）。

圖 7.為 2 條直線計算出 R2 值的示例。(A) x 和 y 值直接相關。(B) x 和 y 值無關。

圖 8.正態分布和標準差。(A) 已顯示數據的正態分布。PCR 效率為 100% 時，2 倍連續稀釋中的兩個連續樣品的平均值之間的 Ct 之差為1（樣品 X 和樣品 Y）。(B) 為了能夠在 99.7% 的情況下為兩個樣品定量，標準差必須低于 1 個 Ct 除以 6 個標準差的值 (1/6 = 0.167)。(C) 為了能夠在 95% 的情況下為兩個樣品定量，標準差必須低于 1 個 Ct 除以 4 個標準差的值 (1/4 = 0.25) 。

圖 9.低拷貝數的泊松分布。藍色曲線代表 3.3 pg DNA（1 個 DNA 拷貝）的泊松分布。粉色曲線代表 6.6 pg DNA（1 個細胞，2 個 DNA 拷貝）的泊松分布。

比較不同的反應條件時，使用效率、R2、精確度和靈敏度來確定 PCR 反應的性能。為了精確嚴謹地評估，表 1 中所列的所有因素都必須評估。除了這些因素，還必須評估和驗證合適的實驗對照（比如無模板對照、無 RT 對照）及模板質量。